酶学实验方法:蛋白质C部分——Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part C
作者：Jon Lorsch
出版：academic press
索书号：Q55/A592/2014/V.541/Y
ISBN:
978-1-60327-814-0
藏书地点： 武大外教中心
本书承接A和B部分，对蛋白质的技术进行提升。三氯乙酸(TCA)蛋白质沉淀通常用于浓缩蛋白质样品或去除污染物，包括盐和洗涤剂，然后用于下游应用，如SDS-PAGE或2D-凝胶。TCA沉淀使蛋白质变性，所以如果蛋白质必须保持其折叠状态(例如，如果你想测量蛋白质的生化活性)，就不应该使用TCA沉淀。
这部分概述了检测两种蛋白质是否相互作用。目标蛋白将使用识别它的抗体(或标记的蛋白版本)进行免疫沉淀。免疫沉淀材料将被SDS-PAGE分离并通过Western blotting分析以评估候选相互作用蛋白的存在。抗体将被固定在溴化氰活化的Sepharose上，用于随后的下拉实验或免疫亲和纯化(参见蛋白的免疫亲和纯化)。
蛋白质通常通过与包括蛋白质在内的其他分子结合而起作用。当蛋白质与其他蛋白质结合时，我们说的是蛋白质与蛋白质的相互作用。很明显，蛋白质与蛋白质的相互作用对细胞内发生的许多过程至关重要，包括信号转导、基因表达调控、囊泡运输、细胞核进出口和细胞迁移。这导致了蛋白质-蛋白质相互作用被认为是药物开发的目标，并使人们对新的蛋白质-蛋白质相互作用的识别越来越感兴趣。
免疫共沉淀是一种用于在活细胞或有机体的环境中确认新的蛋白质-蛋白质相互作用的技术。此外，免疫共沉淀还可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用对细胞内或细胞外刺激的反应动力学，或用于研究突变对蛋白质参与其结合蛋白能力的影响。在免疫共沉淀实验中，通过免疫沉淀分离出感兴趣的蛋白。随后，结合蛋白的存在可以通过免疫印迹法进行评估。
本节的目的是为读者提供疏水相互作用色谱(HIC)纯化蛋白质的指导方针和背景知识。本节将逐步说明如何在实验室中使用HIC净化蛋白质。还提供了一般准则和有关的背景资料。
本节的目的是提供重组蛋白在羟基磷灰石柱上的发展纯化策略，然后使用有效的添加剂优化它们的重复纯化循环。表面中和溶液(SNS)和钙离子的添加降低了羟基磷灰石的溶解度，从而延长了柱寿命。本节指导用户通过纯化方案筛选，然后通过SNS -钙离子补充步骤梯度来纯化来自污染物的单克隆抗体。本节提供简单的分析工具，使用160ml刻度柱来预测流程刻度的柱寿命。但是，鼓励开发工程师在最小的流程列中测试模型。
蛋白质的溶解度受离子的影响。当离子浓度较低(<0.5 M)时，蛋白质的溶解度随离子强度的增加而增加。溶液中的离子使蛋白质分子不受其他蛋白质分子的电荷影响，这就是所谓的“盐析”。在非常高的离子强度下，蛋白质的溶解度随着离子强度的增加而降低，这一过程称为“盐析”。因此，根据蛋白质在高盐浓度下的溶解度，盐析可以用来分离蛋白质。在本方案中，硫酸铵将逐步加入大肠杆菌细胞裂解液中，以分离出不含半胱氨酸残基或标记的20 KD过表达重组蛋白。
离子交换色谱(IEX)是通过表面电荷来分离分子的，不同蛋白质之间的这种性质差异很大。IEX有两种类型，阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。作者设计了以下方案，利用FPLC系统对pI为4.9、含有两个半胱氨酸残基和一个色氨酸残基的重组蛋白进行阴离子交换色谱。在阴离子交换之前，用硫酸铵沉淀将蛋白盐析出来，通过疏水相互作用层析部分纯化。本方案可作轻微修改，以适应相关蛋白和设备的可用性。
这里描述的方案让学生为凝胶过滤柱构建一条标准曲线，分离范围为5 – 250KD。在含有Tris-HCl、NaCl和DTT的缓冲液中稳定的蛋白质种类的大小(水动力半径)是用这个柱确定的。可以对缓冲液进行修改，以适应感兴趣的蛋白质和柱的分离范围。
大约30%的基因组编码膜蛋白。它们是最重要的一类蛋白质，因为它们可以接收、区分和传递细胞内和细胞间的信号。膜蛋白包括细胞粘附分子、转位酶和信号通路中的受体。膜蛋白缺陷可能与许多严重的疾病有关，如神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)和糖尿病。此外，膜蛋白为感染性疾病的分子因子提供了天然的进入点和锚定点。因此，膜蛋白构成约50%的已知和新的药物靶点。根据膜蛋白的特性，需要开发表达和分离的方法和步骤，这减慢了这一领域的进展。需要用一套大量隔离目标的标准步骤，以便对其个别特性进行表征，以便进一步优化。下面给出的标准步骤代表了一个可行的起点。如果需要优化产量，建议改变理论部分中所述的条件。
如果使用膜蛋白，几乎所有的生化技术都可以用于可溶性蛋白，重要的是必须添加洗涤剂以保持膜蛋白在溶液中。这个步骤是为了帮助选择正确的洗涤剂为一个给定的应用程序。
本方案描述了一种变性聚丙烯酰胺凝胶体系，该体系利用十二烷基硫酸钠(SDS)来分离蛋白质分子，其大小是由Laemmli(1970)首次提出的。SDS-PAGE可用于监测蛋白的纯化，检测样品的纯度，对未知蛋白的分子量进行估计。
本方案同时描述了考马斯亮蓝染色法，这是检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质最常用的方法之一(PAGE)。目的是为了检测SDS-PAGE凝胶中纳米数量的蛋白质和核酸。
蛋白质与核酸相互作用的特性是研究多种生物过程所必需的。电泳迁移率测定法(EMSA)是解决这一问题的一种直接且广泛使用的方法，其中核酸与一个或多个蛋白质的结合通过非变性凝胶基质改变其迁移率。通常情况下，核酸的迁移率会降低，但增加迁移率的例子确实存在。这种方法可用于研究蛋白质与核酸相互作用的亲和力、相互作用的特异性、最小结合位点以及相互作用的动力学。EMSA的一个特别优势是能够分析多种蛋白质或蛋白质复合物，并与核酸结合。该方法操作简便，使用方便，是大多数实验室的常用检测手段，然而，有许多变量只能通过经验来确定。因此，优化方案是必要的，并且高度依赖于系统。这里描述的方案是将poly(A)-binding protein (PABP)与43个碱基的非结构化RNA探针结合。虽然这可能是一个有用的步骤，为一些额外的分析，它是建议的反应条件和凝胶运行条件，以适应个人的相互作用的研究。
本文还描述了一种监测核酸与蛋白质结合的方法，允许测定核酸-蛋白质相互作用的表观亲和力。
重组蛋白的表达是生物化学家面临的最棘手的问题之一。通常情况下，宿主生物与产生相关蛋白基因编码的生物是不同的。本文提供了确定蛋白表达是否存在问题的指南，描述了蛋白表达低的可能原因，并介绍了几种可能的解决方案。给出了测定大肠杆菌细胞生长和诱导后蛋白表达的方法。读者应该注意到，低蛋白表达是一个复杂的问题，通常是由多种因素造成的。为了解决蛋白质表达的问题，可能需要结合本文提供的解决方案。本文简要介绍了宿主细胞的表达系统，但主要关注的是大肠杆菌的表达，因为大肠杆菌是最常用的宿主生物。但是，这里讨论的一些方法可能适用于其他表达式系统。
可溶性蛋白的生产一直是生物化学和结构生物学领域的瓶颈。不幸的是，没有解决所有溶解度问题的“灵丹妙药”。以下是一份检测重组蛋白表达是否可溶的方案，以及可能的策略以规避不溶性问题。
Western
blotting是一种功能强大且常用的工具，用于在复杂混合物中识别和定量特定的蛋白质(Towbin et al.， 1979)。该技术能够间接检测固定在硝化纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的蛋白质样品。
《酶学实验方法:蛋白质C部分》一书于2009年由academic press出版，作者是Sonya Vengrova和Jon Lorsch。
《酶学实验方法:蛋白质C部分》一书中，专家研究人员介绍了用于研究蛋白质实验的技术和方法，重点是最近的技术发展，讨论的主题主要包括八个部分，蛋白质沉淀、蛋白质下拉方法、蛋白质纯化、膜蛋白的纯化、SDS PAGE、蛋白-核酸相互作用的体外试验标准、蛋白表达的故障排除、Western Blotting。
《酶学实验方法:蛋白质C部分》一书从各个方面讲解了蛋白质实验的技术内容和研究方法，旨在为想要进一步做蛋白质实验的相关研究人员提供简明易懂的介绍以及方法技术指导。
《酶学实验方法:蛋白质C部分》一书作为分子蛋白质实验的技术专业的研究读物，观点新颖独到，内容饱满详实、语言浅显易懂，除此之外，还包括一些其他的特点：
1、本书分为八个部分，既讲解了蛋白质实验的技术的过程相关基础知识，还讲解了深入研究蛋白质实验的技术理论方面的方法和技术，是一本应用性很强的书籍，对于想要学习如果研究蛋白质实验的技术的研究人员来说是一本很有意义的指导书籍。
2、每个部分都分为很多的小章节，每个章节都是由相关领域的专业人士所撰写，因此，本书讲解既详细又专业，我们能够从中了解到蛋白质实验的技术相关的专业知识以及最新的前沿进展。
总的说来，《酶学实验方法:蛋白质C部分》一书为想要了解DNA复制研究方法的人员提供了清晰的导读路径，作为蛋白质实验技术领域的一本前沿研究图书，是一本值得为想要涉足该领域的人员推荐的专业书籍。
本书目录：
第一部分:蛋白质步骤/蛋白质沉淀
第1章—TCA沉淀
Laura Koontz
第二部分:蛋白质步骤/蛋白质下拉方法
第2章—酵母蛋白的共免疫沉淀
Erica Gerace, Danesh Moazed
第3章-对溴化氰活化的Sepharose的偶联抗体
Jennifer M. Kavran,
Daniel J. Leahy
第4章-共免疫沉淀法分析蛋白质-蛋白质相互作用
第三部分:蛋白质步骤/蛋白质纯化
第5章:疏水相互作用层析技术在蛋白质纯化中的应用
Justin T. McCue
第6章羟基磷灰石层析:重组蛋白的纯化策略
Larry J. Cummings
第7章-硫酸铵沉淀法盐析蛋白质
Krisna C.
Duong-Ly, Sandra B. Gabelli
第8章-离子交换色谱法纯化重组表达蛋白
Krisna C.
Duong-Ly, Sandra B. Gabelli
第9章-凝胶过滤色谱法(大小排除色谱法)的蛋白质
Krisna C.
Duong-Ly, Sandra B. Gabelli
第四部分:蛋白质步骤/膜蛋白的纯化
第10章-膜蛋白的表达与纯化
Jan Kubicek, Helena
Block, Barbara Maertens, Anne Spriestersbach,
Jorg Labahn
第11章-说明章:选择正确的洗涤剂
Dirk Linke
第五部分:蛋白质步骤/SDS PAGE
第12章一维SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D SDS-PAGE)
Julie L. Brunelle, Rachel
Green
第13章-考马斯蓝染色法
Julie L. Brunelle, Rachel
Green
第14章- SDS -聚丙烯酰胺凝胶的银染色
Jennifer M. Kavran,
Daniel J. Leahy
第六部分:蛋白质步骤/蛋白-核酸相互作用的体外试验标准
第15章-蛋白质-核酸相互作用的体外标准测定
Sarah F. Mitchell, Jon R. Lorsch
第16章-蛋白过滤结合
Sarah Kolitz, Jon r Lorsch
第七部分:蛋白步骤/蛋白表达的故障排除
第17章-说明章:重组蛋白表达的疑难解答
Krisna C.
Duong-Ly, Sandra B. Gabelli
第18章-说明章:蛋白质表达故障排除:当蛋白质不能溶解时该怎么做
Krisna C.
Duong-Ly, Sandra B. Gabelli
第八部分:蛋白方案/Western Blotting
第19章-使用化学发光底物的Western Blotting
Alice Alegria-Schaffer
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