Methods in Enzymology:Laboratory Methods in Enzymology: Protein Part B（Volume 539）

——酶学方法:酶学实验室方法:蛋白B（卷539）

作者：Jon Lorsch

索书号：Q55/M592/2014/V.539/Y

ISBN: 978-0-12420-120-0

藏书地点：武大外教中心

这本书的每一个章节都是由经常使用这项技术的研究人员编写的，这些方法非常详细，并包含配方必要的缓冲液和试剂，以及概述步骤的流程图。许多章节都附有演示视频、程序的关键部分。本文的目标是这些方法对实验室里从本科生到研究生的每个人都有用。

本文描述了在大肠杆菌的游离系统中生成蛋白质的方法。蛋白质的体外合成已被用于研究基于核糖体的基因调控步骤。这种技术也被用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质- RNA的相互作用，并产生放射性标记的蛋白质物种。最近，这些方法被用于生产大量的有毒蛋白质，用于蛋白质组学和结构研究(Yokoyama等人，2000年)。

真核细胞体外翻译系统自20世纪70年代开始使用。这些系统可以忠实地合成多肽进行mRNA的编程，使生产的多肽进行分析，以及允许分析顺式和反式因素，调节翻译。本文介绍了无细胞翻译系统的制备和应用。

酵母双杂交是一种筛选大量基因产物(由cDNA文库编码)与感兴趣蛋白相互作用能力的方法。这个系统也可以用来描述和操纵候选蛋白质:蛋白质相互作用。蛋白质之间的相互作用由酵母在选择性培养基上的生长来监测。

RNA -蛋白相互作用在细胞功能调控中起着不可或缺的作用。这些复合物的生化特征通常是通过RNA结合蛋白(RBPs)的免疫沉淀(IP)，然后识别共免疫沉淀的RNA。该方案将紫外线(UV)照射与IP相结合，以确定活细胞中特定的蛋白质是否与特定的RNA直接相互作用。RNA 和蛋白复合物对基因表达的几乎所有方面都至关重要。RNA 和蛋白质相互作用的分析可能会因为天然复合物的破坏和细胞裂解后新的重组复合物的形成而变得复杂。在得出特定RNA和蛋白质在体内相互作用的结论之前，可以进行细胞混合实验，以确保观察到的RNA -蛋白质复合物不会在细胞裂解后形成。

本文中也描述了使用水溶性胺反应的同型生物功能性BS3(双[磺基琥珀酰亚胺]亚叶酸盐)进行蛋白质间交联的一般程序；但是，可以使用其他具有类似属性的交叉链接轻松地调整协议。BS3由两个硫酸盐- nhs酯基团和一个11.4 A连接基团组成。磺酸- nhs酯基团与初级胺在弱碱性条件下(pH 7.2-8.5)发生反应，生成稳定的酰胺键。该反应释放出n -羟基琥珀酰亚胺(参见NHS酯衍生化法在荧光团蛋白上的应用)。

转录因子结合位点的全局识别是阐明基因组功能元件的关键步骤。已经开发了几种方法来映射TF在人类细胞、酵母和其他模型生物中的结合。这些方法利用染色质免疫沉淀(ChIP)，利用活细胞甲醛固定可以将DNA序列交联到在体结合的TFs。在ChIP中，将交联的TF-DNA复合物通过超声切割、大小分级，并与感兴趣的TF特异性抗体孵育，生成一个与TF结合的DNA序列文库。ChIP是全球首个识别tf结合DNA序列的技术，随后将芯片DNA与寡核苷酸芯片杂交。然而，芯片被证明是昂贵的，劳动密集型的，并受限于固定数量的探头可用的微阵列芯片。ChIP- seq将芯片与大规模并行高通量测序相结合(参见解释章节:下一代测序)，并在时间和成本、信噪比和分辨率方面证明了与ChIP- ChIP的巨大改进。特别是，在ChIP-Seq分析中，多重测序可以实现更高的吞吐量，该分析涉及的生物的基因组比人类的低复杂性(Lefrancois et al.， 2009)，从而降低成本和每个结果所需的时间。本节描述的多重ChIP-Seq方法是针对秀丽隐杆线虫开发的，但很容易适用于其他生物体。

我们最近开发了一种RNA识别元件的全转录组分离方案，适用于直接接触细胞培养模型中自然或体外表达的RNA(包括RNA解解酶、聚合酶或核酸酶)的任何蛋白或核糖核酸复合体(Hafner et al.， 2010)。简单地说，先对感兴趣的RNA结合蛋白进行免疫沉淀，然后分离出交联和共免疫沉淀的RNA。在裂解液制备和免疫沉淀过程中，mRNA被核糖核酸酶T1部分降解。分离出的交联RNA片段被转换成cDNA文库，并使用Solexa技术进行深度测序(见解释章节:下一代测序)。通过引入在交联时产生特征性序列变化的光反应性核苷，我们的方案允许将相关蛋白结合的RNA片段从背景非交联RNA中分离出来。

酵母三杂交系统已应用于已知的蛋白质——RNA相互作用的各种目的。例如，蛋白质和RNA的突变与改变或放松的结合特异性可以被识别。突变RNA也可以被分析，以更好地了解特定蛋白质的RNA结合特异性。此外，该系统补充了其他生化技术，如SELEX、共免疫沉淀和交联实验。酵母三杂交系统可以通过筛选融合到转录激活域的cDNA文库，以混合RNA为诱饵，来识别已知RNA序列的蛋白伴侣。最常见的情况是，这样的筛选是为了在体内识别与特定RNA相互作用的蛋白质。该三杂交系统可用于识别结合特定蛋白的RNA序列，方法是筛选一个混合RNA文库，以蛋白激活域融合为诱饵。这些筛选补充了生化技术，例如SELEX、共免疫沉淀和交联实验。

本文目录：

第一部分:蛋白实验方案/蛋白体外翻译

第一章:细菌提取物中蛋白质的体外

Hani S. Zaher, Rachel Green

第二章:酿酒酵母无细胞提取物的制备

Cheng Wu, Matthew S. Sachs

第二部分:蛋白质实验方案/蛋白质体内结合试验

第三章酵母双杂交筛选

Lauren Makuch

第四章:培养细胞中相互作用的RNA与蛋白质的紫外交联

Emi Sei, Nicholas K. Conrad

第五章细胞混合法分析RNA与蛋白质的相互作用

Sarah H. Stubbs, Nicholas K. Conrad

第六章:蛋白质间的交联

Alice Alegria-Schaffer

第七章:染色质免疫沉淀和多重测序(ChIP-Seq)，以确定秀丽隐杆线虫的全球转录因子结合位点

Cathleen M. Brdlik, Wei Niu, Michael Snyder

第八章- PAR-CLIP(光激活核糖核酸增强交联和免疫沉淀):一个逐步识别RNA结合位点的转录组级协议

Jessica Spitzer, Markus Hafner, Markus Landthaler, Manuel Ascano, Thomas Tuschl

第九章-使用三杂交系统测定RNA结合蛋白的RNA特异性和靶标

Yvonne Y. Koh, Marvin Wickens

第十章-使用酵母三杂交系统分析已知的RNA -蛋白质相互作用

Yvonne Y. Koh, Marvin Wickens

第十一章-使用酵母三杂交系统识别结合已知RNA序列的蛋白质

Yvonne Y. Koh, Marvin Wickens

林岚武汉大学生命科学学院博士研究生