Single-Molecule Studies of Nucleic Acids and Their Proteins

作者：David Bensimon, Vincent Croquette, Jean-François Allemand, Xavier Michalet, and Terence Strick

索书号：Q523/B474/2019/Y

ISBN：9780198530923

藏书地点：武大外教中心

核酸包括DNA和 RNA ,它们是遗传信息的携带者,在生物体中起中心作用,因而对核酸的研究也在逐步增多。X射线散射和核磁共振(NMR)技术在这个领域中有很重要的应用,因为它们能够提供核酸、核酸-蛋白质复合物的高精度的结构信息。这种结构上的信息结合动力学的研究,能揭示生物大分子行使功能时分子重排的构象(conformations)、能量变化(energy landscapes)、长度(length)和时标(time-scales)等一系列特征。应用核酸的单分子操作技术,可通过施加一定的外部机械限制(力和/或扭矩)去测量分子的长度、力、角度、扭矩随时间的变化。实验一般在溶液中进行，通过测量在生物化学过程中产生的力以及研究作为外加机械负荷而发生的相应反应等，可得到核酸的折叠动力学和弹性性质等相关信息。

单分子操作技术是指应用一定的实验仪器和方法，对单个分子进行操作，它包括原子力显微镜技术，光镊技术，单分子荧光光谱技术等。

原子力显微镜(Atomic Force Microscopy , AFM)是由 BM公司的 Binnig 与斯坦福大学的Quate于1985年发明的，其目的是为了使非导体也可以采用扫描探针显微镜(SPM)进行观测。原子力显微镜通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力(原子间力)来获得物质表面的形貌。原子力显微镜将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，当一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。

光镊技术(Optical tweezers)是Ashkin等在20年前发明的，它的原理是利用激光动量转移产生的辐射压力，从而形成具有梯度力场的光学陷阱，处在陷阱中的微粒受到梯度力场的作用，就被“钳住”。这个光学陷阱像是一把小镊子，因此被称为“光镊”。如果在小球上连结上生物大分子，并且把小球“钳住”在光学陷阱中，可以在溶液环境中对生物大分子进行操作。光镊是测量和控制生物大分子的有力工具。用这种技术可以测量出生物大分子间微弱的力(皮牛顿量级)以及生物大分子的很小位移(纳米量级)。

单分子光谱技术(single-molecule spectroscopy ,SMS)是将荧光基团标记在生物大分子上，标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化，通过光谱分析等就能够得到有关分子间相互作用、酶活性,反应动力学、构象动力学、分子运动自由度以及在化学和静电环境下活性改变的信息。

单分子操作技术已经越来越多地应用到核酸研究当中，并且取得了重要的进展。这些研究包括：DNA 的打开与修饰、DNA凝聚、蛋白质-DNA相互作用、复制和转录等。

核酸单分子操作研究起始于1992年 Smith等对单个DNA分子的弹性测量。一段双链DNA分子的一端连接到玻璃表面上，另一端连接到磁性小球上。DNA分子连接到不同固体表面是通过生物素-链霉抗生物素蛋白地高辛免疫的特异反应来实现的，这类方法至今仍是这个领域的常用方法。整个体系的组装在溶液中完成，在外加磁力的作用下，DNA被拉伸，借助于显微镜，就能测量到小球的位移。这样，就可以得到在不同盐浓度缓冲液中的单个λ-DNA多聚体(48502个碱基对)的力延伸曲线，并且在这个实验中力最大只增加到10皮牛顿。在作用力很小的体系中，双链 DNA的弹性是由熵的竞争所控制, 熵的竞争导致DNA分子螺旋，而外部作用力则拉伸DNA分子。在力延伸曲线中可观测到一重要偏离,而这与高聚物弹性自由连接链模型(the freely jointed chain model of polymer elasticity)预测相一致，表明DNA 在溶液中有重要的局部弯曲。在蠕虫样链模型(the wormlike chain model)中，DNA分子是一个热量变动诱导延伸的弹性管子,它能提供双链DNA在微力作用下弹性变化较好的理论解释。

当大于60pN外加作用力作用于 DNA上时,一个意想不到的现象出现了：双链 DNA分子发生了70 %的过度延伸。这种现象的出现是由于DNA发生了结构上的转变，转到了一个称之为S-DNA的时相。尽管有许多关于S-DNA结构的实验和理论的研究，SDNA的结构仍然备受争议。在Cuzel等的实验中，利用一根光纤作为力传感器，DNA分子一端连接在光纤上，另外一端连接在小球上，小球通过吸力作用被固定在一个微吸液管上。移动微吸液管,DNA分子就被拉伸，光纤因此发生偏移，通过一个位置敏感的光敏二极管检测传送的激光束信号来记录光纤偏移的位置。在Smith等的实验中，两个小球分别连接到DNA分子的两端，一个小球由微吸液管控制，另外一个小球由光镊子控制。光镊子不仅能“钳住”小球，也能作为力传感器，因而能够测量作用力的大小。移动微吸液管，两小球之间的距离变大，DNA分子被拉伸，因此得到力延伸曲线。应用这种实验装置能对单链DNA和双链DNA进行弹性测量。

DNA凝聚对于亲代细胞准确分裂成两个子代细胞来说是必须的，因为压缩状态的DNA比处于伸展状态的 DNA更容易分裂。细菌染色体 DNA压缩成一个拟核，而真核生物细胞使用一个更为精致的有丝分裂机制来完成染色体的压缩。在这两类生物中，染色体结构维持蛋白(SMC)在 DNA凝聚的过程中起关键作用。DNA 凝聚在许多领域引起了人们越来越多的兴趣，如基因治疗、细胞生物学和滤过性微生物学等领域。几种不同外界因素也能够诱导DNA 凝聚，如多胺(精胺和亚精胺)、四氮六甲环化钻、三价(或高价)金属离子、生物大分子荧光染料探针(如叶啶橙)、阳离子聚合物(如聚乙烯乙二醇、PEG)等。这几种因素能够单独或联合作用诱导 DNA凝聚。DNA分子与这些因素作用并迅速降温,从而发生凝聚,从B型结构转变到A型结构。在DNA凝聚过程中，DNA会凝聚成环状，棒状等不同形状。

《核酸及其蛋白质的单分子研究》一书于2019年由Oxford Graduate Texts出版社出版，作者是David Bensimon, Vincent Croquette, Jean-François Allemand, Xavier Michalet和Terence Strick。这本书提供了了解核酸(DNA, RNA)的弹性特性的基础，用于操作它们的方法(如光学成像等方法)，以及如何观察它们与蛋白质的相互作用(如荧光显微镜，FCS, FRET等)。然后举例说明了这些方法在三类DNA酶：聚合酶、解旋酶和拓扑异构酶的研究中的应用。本书为读者将这些方法应用到DNA/RNA的研究提供思路。

本书作为核酸及其蛋白质的单分子研究的专业书记，内容专业详实，语言浅显易懂，除此之外还有以下特点：

1、本书不仅介绍了核酸及其蛋白质的单分子研究的基础知识，还详细介绍了这些研究的方法和技术，并结合具体实例的应用，说明了这些方法在三类DNA酶：聚合酶、解旋酶和拓扑异构酶研究中的应用。

2、索引文献丰富，证明了这本书的知识性，真实性。而且，这些索引文献绝大部分都是最新研究，让读者全面了解该领域的前沿进展。

3、在本书的最后，将出现的专业词汇都罗列出来，大大方便了大家在阅读过程中对核酸及蛋白质研究专业术语的认知。

4、本书最鲜明的特点就是语言浅显易懂，对于初学者有很大的帮助。

本书目录

1. 介绍DNA

2. 操纵DNA

3. 荧光光谱和显微镜技术

4. 核酸的机械特性

5. DNA中的结构转变

6. DNA相关马达的单分子研究

7. DNA和RNA聚合酶

8. DNA解旋酶

9. 拓扑异构酶

10. 结论

兰天武汉大学生命科学学院硕士研究生