新微生物学：从微生物群到CRISPR

The New Microbiology: From Microbiomes to CRISPR

作者：Pascale Cossart

出版社：ASM Press

索书号：Q33/C836/2018/Y

ISBN：9781683670100

藏书地点：武大外教中心

微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。人们通常要借助光学显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构。微生物类群包括原核生物，真核生物（原生生物，真菌），非细胞生物等。原核生物包括细菌，蓝藻，防线菌，支原体，衣原体，立克次氏体等。原生生物包括原生动物（变形虫，喇叭虫等），原生植物（衣藻等）等单细胞真核生物。真菌包括酵母菌，霉菌，木耳，蘑菇等。非细胞生物主要是病毒和亚病毒等。CRISPR系统可以说是不起眼但是却有大作用的。CRISPR比较简单，廉价，高效，并可以针对多个目标，它是生命进化的历史上，细菌和病毒产生免疫战斗武器。DNA双链断裂是通过Cas9蛋白形成，NHEJ修复和INDEL效应（插入和删除），导致基因突变和基因敲除。通过同源重组可以实现基因精确编辑的目的。病毒可以将自己的基因注入细菌，使用工具复制服务的基因，在侵袭性细菌基因的病毒清除细菌细胞的CRISPR系统的演化，利用这个系统，细菌就悄悄地从他们的染色体切除病毒的基因，这是对细菌的免疫系统独特。发现与原核CRISPR系统的应用再次证明了低等生物意识的存在。

细菌之间的社会联系是一门相当复杂的一个过程，细菌之间可能存在共生关系，相互依靠，互取所求来达到更好的生存条件让自己生存繁衍下去。当然也存在一些“自私细菌”，为了更好的抢夺资源和占领自己菌群的一席之地，会分泌一些有毒物质杀伤环境中的其他细菌，这种毒素物质往往对自身和同类也具备杀伤作用，细菌为了保护自身，基因上会携带有这些杀伤物质的免疫蛋白来中和毒性，所以一般来说同种菌群间应该不会自相残杀。

单个或少数细菌(或其他微生物的细胞、孢子)接种到同体培养基表面，如果条件适宜，就会形成以母细胞为中心的体形较大的子细胞群体。这种由单个或少量细胞在固体培养基表面繁殖形成的、肉眼可见的子细胞群体称为菌落。大量真菌或细菌形成肉眼可见的集团时叫做菌群。生活在健康动物各部位、数量大、种类较稳定、一般能发挥有益作用的微生物种群叫做正常菌群。如果正常菌群与宿主间或正常菌群各菌种间的平衡被打破，就会出现菌群失调，致病作用就会显著，严重者引起二重感染。所以找到完美调节这些所谓菌群生长繁殖的秘密手段具有非常重要的临床意义。目前已有大量的科学家将目光聚焦到CRISPR/Cas技术调控菌群生长的这个领域，我相信在不久的将来科学家们会有不小的突破。

CRISPR/Cas这项技术自从问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声，在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，但其实CRISPR/Cas系统早就存在自然界中了。CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫（类似于哺乳动物的二次免疫），当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。是不是觉得和真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理很相似？正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

CRISPR/Cas的强大之处在于，其可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（看成外源DNA）将被精确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。最基础的应用就是基因敲除。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA（gRNA1，gRNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，gRNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。随后生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入（Knock-in）或定点突变（site-specific mutagenesis）。这样就可以实现基因的替换或者突变。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用，除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。

利用CRISPR系统实现对微生物基因的表达调控大致有以下几个方向。应用微生物学方向：一是以农业害虫微生物防治的基础与应用研究为特色，主要包括高效杀虫杀螨真菌资源及其抗逆功能基因发掘，丝孢类生防真菌的基因操作、性状改良及工程菌构建，害虫真菌性病害的流行机制及调控途径，病原真菌与寄主昆虫的互作关系，真菌杀虫剂、杀螨剂新产品及新技术的研发与应用。二是微生物酶工程，主要包括功能酶的微生物及其基因资源发掘，多功能融合酶构建，酶的纯化及其制剂技术。环境微生物学方向：重金属和有机物污染影响下的微生物生理生化、分子生态特性及其基因表达产物，污染环境微生物的生态适应性及其机制，微生物对污染环境的生物修复及其机理。极端环境微生物学方向：嗜盐、嗜碱、嗜热、嗜冷、耐辐射微生物的物种资源及功能基因利用，耐辐射机理及调控网络，光敏蛋白的高速光开关应用，高盐污水的治理。工业微生物学方向：耐高温、耐高糖、耐酒精、高转化率酵母遗传工程菌构建与相关基因表达调控及其机理研究，药物功能基因克隆表达、工程菌构建与微生物次生代谢及其调控机理研究。分子微生物学方向：细菌信号传递的分子机理研究及其调控，芽孢杆菌芽孢生成的调控研究，细菌二元调控系统的整合性研究，微生物基因资源挖掘、验证及应用。

微生物学在过去的几十年里经历了根本性的变化并开创了一个科学新纪元。在《新微生物学》一书中，帕斯卡尔·科萨特生动细致的讲述了关于微生物学革命的一系列故事。这些故事的缘由对人类健康和医学、农业、环境科学以及我们对进化的理解有着广泛的影响。这场革命源于分子和细胞生物学、基因组学和生物信息学的强大工具，其中生物信息学这些工具产生了很多从全基因组序列到细菌入侵宿主细胞的新发现。这本书适用群体不分类别，无论是相关领域的研究者，还是与生物领域接触不多的人群，都可以在这本书中找到很多乐趣，学到很多知识。

1.微生物的新概念

2.微生物社会学：细菌的社会性活动

3.病毒感染

4.细菌作为工具

朱旺武汉大学生命科学学院硕士研究生