《CRISPR-Cas9系统的基因工程》
Genome
Engineering via CRISPR-Cas9 System
作者：Mike Cassidy
出版社：Cambridge University Press
索书号：Q78-C335c -2020Y
ISBN：978-0128181409
此书汇集了全球知名科学家在CRISPR-Cas9系统方面建立的专业知识。目前，靶向基因工程由于其设计、使用和应用相对简单，是基础科学、生物医学和工业应用的关键技术。这本书包含了CRISPR在细菌、病毒、藻类、植物和哺乳动物研究中的广泛应用，也讨论了果蝇、斑马鱼和原生动物等的建模。
其他主题包括诊断，传感器和治疗应用，以及伦理和监管问题。这本书不仅是基因工程初学者的宝贵资源，而且对研究人员、临床医生、利益相关者、政策制定者和在几个领域对CRISPR-Cas9的潜力感兴趣的实践者也是一个宝贵的资源。对如何在不同的生物体中设计、使用和实现CRISPR-Cas9系统提供了基本的理解和清晰的画面，还解释如何使用CRISPR创建用于疾病研究和筛选目的的动物模型讨论CRISPR-Cas9系统在基础科学、生物医学、病毒学、细菌学、分子生物学、神经学、癌症、工业等领域的应用。
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
CRISPR最早在细菌和古细菌中被发现，很可能是是生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。入侵病毒的短DNA序列（spacers）插入的细菌基因组的CRISPR基因位点，从而充当初次感染的“记忆子”。再次感染会激发补充成熟CRISPR RNA（crRNA）寻找匹配的序列，在特异的外源DNA序列处形成双链断裂。
CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。
一旦crRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/crRNA复合体能够识别PAM(5'-NGG)位点导致DNA解旋，使crRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与crRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA 异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，导致DNA降解。如果crRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复，而非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误，从而达到定点敲除某种基因的目的。
在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。因此现在我们用的CRISPR/Cas9工具只有Cas9核酸酶和gRNA两部分。应用此工具，我们可以非常方便快捷的进行任意基因的编辑改造，比如基因敲除，敲入，定点突变等等。CRISPR/Cas9机制可用于包括哺乳动物细胞在内的各种系统的基因工程中,如下图所示。
CRISPR/Cas9的成功与否的关键问题在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效应。
每一个行业都在向Crispr投入大量的资金——制药、农业、能源、材料制造。甚至连那些大麻贩子都想砸钱进去。这些公司正在利用它来制造治疗癌症的药物、对抗气候变化的作物、能渗出生物燃料的藻类和自我终止的蚊子。学术研究人员几乎普遍采用Crispr来更深入地了解其模型生物的生物学。支持这一生物黑客盛宴的是一个日益拥挤的Crispr后端供应链；企业建立基因编辑器设计工具和运输合成指南RNA或Crispr之前的细胞系到这些公司的大门。然而，到目前为止，只有很少的Crispr增强产品能够实际进入到消费者的手中。取而代之的是，夸张的头条新闻引发了社会对这项技术的希望和恐惧，从拯救濒临灭绝的物种到引发超级婴儿的军备竞赛。
就目前而言，Crispr仍然是生物学家的流行语。但是就像计算机从一个乏味的、专门为数学爱好者设计的工具演变成了我们身体无处不在的、无形的延伸一样，Crispr总有一天会无缝地编织到我们现实的结构中。如果这只是一个生物性的问题，问题很容易就能解决。
以工业发酵为例。在老式基因工程技术的帮助下，科学家们已经将大肠杆菌和啤酒酵母等微生物，重新编程到可以生产从胰岛素到乙醇等各种物质的工厂中。Crispr将迅速扩大生物精炼厂所能生产的设计化学品、分子和材料的目录。自愈合混凝土？耐火、以植物为基础、比铝还轻的建筑材料？完全可生物降解的塑料？Crispr不仅使所有这些成为可能，也使大规模生产它们成为可能。
但是，我们现在拥有的工具无法达到这个目标。这就是为什么研究人员现在竞相绘制更清晰的Crispr世界的全貌。此时此刻，他他们正在全球范围内搜寻模糊细菌的序列，他们正在修补已经发现的系统。他们每遇到一个有希望的新核酸酶就申请专利，在未来的十年里，这个列表一定会扩大。每一种新的酶不仅将提高Crispr的基因编辑能力，而且还会将它的能力扩展到远远超出DNA能处理的范围。你看，切片和切割并不是对DNA能做的唯一有趣的事情。新的Crispr系统可以临时切换基因的开关或监测基因组，以修复突变，因为它们是实时的，所以不需要剪切。第一种方法可以让科学家在不永久改变病人DNA的情况下，治疗某些物质（如胰岛素）含量过高或过低的人类疾病。第二种方法有一天可以预防癌症等疾病的发生。Crispr的特性，可能超过了它实际的切割机制，它将激发出我们无法想象的应用。
目录
1.基因编辑的CRISPR/Cas9系统的介绍
2. CRISPR/Cas9系统演化与分子机制
3.探索可移除人体内病毒的CRISPR/Cas9系统
4.可程序化的移除病原体的CRISPR/Cas9系统
5.真菌里的靶向基因编辑的CRISPR/Cas9系统
6.工业化应用的真菌里的靶向基因编辑的CRISPR/Cas9系统
7.哺乳动物的CRISPR/Cas9系统发展与挑战
8. CRISPR/Cas9系统可能在癌症治疗中发挥作用
9. CRISPR/Cas9系统疗法
10.Cas蛋白改进以提高CRISPR/Cas9系统作用效益
11. CRISPR/Cas9系统在植物中的应用
12. 用来提升水果产量的CRISPR/Cas9系统
13. CRISPR/Cas9系统提升植物的抗病毒能力
14.植物的CRISPR/Cas9系统疗法
15. CRISPR/Cas9基因编辑系统用于改进藻类产生生物燃料
16. CRISPR在工业应用的发展与用途
17. CRISPR/Cas9系统在细菌里的基因沉默优势
18. CRISPR/Cas9系统用于基因插入
19.最新CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的研究进展
20. CRISPR：一个跨时代工具可用于基因编辑处理原核寄生虫
21. 现有的CRISPR挑战：生物研究安全、生物安全、专利以及监管问题
王昊宇 武汉大学生命科学学院 博士研究生