《荧光蛋白的革命》
The
Fluorescent Protein Revolution
作者：Richard N. Day, Michael W. Davidson
出版社：CRC Press
索书号：Q51/F646/2019Y
ISBN： CRC
Press
荧光蛋白在某种定义下可以说是革新了生物学研究--运用荧光蛋白可以观测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等等。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。
最早出现的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。其中水母GFP是由238氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27KD，GFP荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。
但此前穿透性最强的荧光蛋白质也不能帮助研究者看到活体生物体皮下更深层的状况。现在，随着俄罗斯科学院的Dmitriy Chudakov最近培育出穿透性极强的深红色荧光蛋白质，利用荧光蛋白质进行的生物研究领域将出现重大突破。
Chudakov是抓住一个偶然的机会从而培育出这种穿透性超强的深红色荧光蛋白质的。他的一个同事在逛莫斯科宠物商店时发现了一只颜色深红的海葵，出于职业的直觉，他将海葵带了回来;然后，他们对海葵的荧光蛋白质分子进行诱变，最终得到了一种能够在生物体内稳定存在，同时能发出更明亮红光的蛋白质。Chudakov已在人体细胞和青蛙身上测试了这种新的荧光蛋白质。在动物实验中，他发现从外界就可以明显看到这种深红色荧光蛋白质从小动物肌肉组织深处发出的亮光，而同种处于肌肉组织深处的一般荧光蛋白质发出的光则几乎看不见，Chudakov准备下一步在白鼠身上实验这种荧光蛋白质。
斯坦福大学分子影象中心的科学家Zhen Cheng对这项发现评价道:"红色光对生物体组织的穿透性远胜于其他颜色，正因为此，目前有很多科研人员都在努力培育具有高稳定性的红色荧光蛋白质，但截至目前尚没有哪一个比Chudakov培育出的荧光蛋白质更稳定、更明亮，Chudakov培育出的这种深红色荧光蛋白质将大大提高生物体活体成像的质量，并在实时追踪活生物体内深层组织的分子活动上得到广泛的应用"。
同一般荧光蛋白质相比，这种深红色荧光蛋白质能释放出波长更长的光，因而能更好地用于活体动物内脏的深度成像，从而有助于研究人员在活生物体身上非侵入式地进行癌细胞发展和治疗过程的实时研究，使我们对癌症等疾病的发病过程有更深入的了解。而一般荧光蛋白质由于穿透性比较弱，研究人员研究时不得不将肿瘤移植到皮下浅层或其他模拟环境下(如活体解剖成像或活体组织切片成像)进行研究。此前最为成功的荧光蛋白质是一种增强的绿色荧光蛋白质，但其稳定性差，光的穿透性也不如新发现的深红色荧光蛋白质好。
在蛋白质组学研究中,将荧光蛋白与目标蛋白质融合表达，微阵列中的荧光信号与蛋白质成分成正比,可以非常容易地利用传统的荧光扫描进行检测,能够探明蛋白质间的相互作用,而不需要其它蛋白质标记步骤,操作简便易行。DNA结合蛋白与绿色荧光蛋白的融合产物与芯片上的DNA结合后,利用绿色荧光蛋白的单克隆抗体进行检测,证明可以将目标蛋白与DNA结合蛋白融合,实现蛋白质互作的微阵列检测。
通过翻译融合构建的标记载体,其表达产物为融合蛋白,同时具有.上游蛋白因子的生物学功能和下游发光基因的发光表型,通过发光表型研究蛋白因子的亚细胞定位已经变得非常方便[14]。李睿等采用重叠_PCR方法,扩增获得绿色荧光蛋白(GFP)和黄瓜花叶病毒运动蛋白的(CMV MP)融合基因,将其克隆到pKEN上,构建了该融合基因在大肠杆菌DH5a中正常表达。激光共聚焦显微镜分析表明,在488nm紫外光激发下,菌体呈亮绿色,表明融合蛋白保持绿色荧光特性。该实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其它细胞成分的作用关系奠定了基础。
利用GFP和RFP的二元载体可以进行BAC文库的亚克隆。例如，质粒载体pGFP具有表达GFP与RFP融合蛋白的特性,gfp基因与rfp基因间由一段具有多克隆位点衔接序列连接,将BAC文库用鸟枪法打成小片段连接到质粒载体gfp基因与rfp基因之间,那么阳性克隆会阻断rfp基因的表达，而显现出绿色荧光,未插入目的片段的rfp基因表达不被阻断,而显现出橙色荧光,阳性克隆易于筛选。克服了诸如LacZ基因仅能用于固体培养的缺点, 可以固体培养筛选,也可以利用流式细胞仪将具有阳性信号的细胞分离达到筛选的目的。
荧光蛋白在生命科学研究中扮演着越来越重要的角色。近年来,它用于医学、细胞生物学、发育生物学等方面的研究,使原有的研究技术不断提高，领域不断延伸。荧光蛋白能稳定转染肿瘤细胞,便于研究正常细胞与肿瘤细胞互作;通过荧光蛋白进行大规模、高通量的抗癌药物筛选; 荧光蛋白用于分子成像，能帮助肿瘤的早期诊断。在发育生物学和神经生物学研究领域都有越来越多的成功应用，并使神经形态学与功能学研究相结合成为可能，如利用荧光蛋白研究线虫神经发育、小鼠的发育标记、神经多肽转运因子的荧光蛋白标记等。用GFP标记的抗原或抗体取代传统的免疫学标记方法,不需要再加任何底物而建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。不同颜色的荧光蛋白标记。不同的组织,使得研究细胞质、细胞核、细胞骨架、细胞分裂、胞内运输等细胞结构和动力学更为便利。借助新的设备和成像技术如激光共聚焦显微镜其应用范围将更为广泛,可用于研究病毒与宿主的相互关系;微生物在机体内的感染途径;此外GFP作为荧光材料在商业上也将有很好的应用前景。荧光蛋白还可以监测转基因生物中选择标记基因的消除,其在转基因植物中的应用也越来越广泛。随着对荧光蛋白研究的深人及改造,其荧光特性将更好地发挥出来,荧光蛋白的应用领域也会进- -步拓宽,各种荧光蛋白将带给我们一个绚丽多彩的科学世界。
《荧光蛋白的革命》一书于2019年由CRC Press出版，作者是Richard N. Day和Michael W. Davidson。荧光蛋白、活细胞成像和超分辨率仪器的进步开创了细胞生物学、医学和生理学研究的新时代。这本书首先追溯了荧光蛋白的历史以及它们在细胞成像中实现的革命。然后讨论具有新光物理特性的荧光蛋白。本书还涵盖了几个前沿的成像应用。这些包括细胞精细结构的超分辨率显微镜、FRET显微镜来可视化活细胞内的蛋白质相互作用和细胞信号活动、光漂白和光活化技术来可视化蛋白质行为、利用植物和藻类光感受器来实现酶活性的光调节控制的技术，以及活体动物肿瘤-宿主相互作用的无创成像。
本书以彩色形式呈现了该领域的基本原理和最新进展，包括利用荧光蛋白的成像技术的相关发展。它适用于从光学成像专家到需要对该领域进行介绍的新手的广泛受众。
本书作为讲述细胞生物学研究方法的书籍，内容专业详实，语言浅显易懂，具有以下特点：
1、语言精练，深入浅出。
2、理论结合实际应用，帮助读者进一步加深理解。
3、罗列专业词汇，大大方便了大家在阅读过程中对书中专业术语的认知。
4、配图丰富，帮助读者理解。
本书目录
第一部分：历史和观点
1.
荧光蛋白简介
第二部分：荧光蛋白的光物理学性质
2.
荧光蛋白结构研究的经验教训
3.
荧光蛋白的优化
4.
珊瑚荧光蛋白颜色的开发
5.
红色荧光蛋白：多用途活细胞成像标记
6.
光学高光器的物理性质
7.
远红外和近红外荧光蛋白
第三部分：应用程序
8.
荧光编码蛋白和FRAP
9.
光学荧光笔：在细胞生物学中的应用
10.
从植物感光器中提取的光遗传学工具
11.
荧光蛋白的FRET：检测活细胞中的蛋白质相互作用
12.
使用荧光蛋白的超分辨率技术
13.
体内成像革命
14.
遥感与植物资源管理
王昊宇 武汉大学生命科学学院 博士研究生